Ingeniería de proteínas

El conocimiento de los procesos evolutivos de la vida en la Tierra, ha dado la pauta en la innovación de llevar algunos de estos procesos al laboratorio para beneficio de la humanidad, como es la replicación de ADN y la síntesis de proteínas. El ADN contiene la información necesaria para la producción de una proteína. En el siglo pasado, se comenzaron a sentar las bases teóricas y experimentales para replicar ADN en el laboratorio, generando una de las técnicas experimentales fundamentales en la biología molecular, la reacción en cadena de la polimerasa (“Polymerase Chain Reaction”, PCR). A partir de la cual se comenzaron a implementar otras técnicas como la mutagénesis y la evolución dirigida, que finalmente forman parte de la Ingeniería de proteínas. La Ingeniería de proteínas consiste en modificar una proteína en un solo residuo de aminoácido, en una región, eliminando o insertando un fragmento de otra proteína, o fusionando dos proteínas, todo esto a partir de modificar la secuencia de ADN, con la finalidad de obtener una proteína con mejores características que la proteína inicial.

Método de inducción, aislamiento y selección de proteínas HRP de bacterias fitopatógenas, una fuente potencial de inductores de resistencia vegetal

Xanthomonas vesicatoria es una bacteria Gram negativa y patógena de una gran variedad de especies vegetales, entre ellas especies de importancia económica para México como chile (Capsicum annuum) y jitomate (Solanum licopersicum). El grupo de genes hrp es conservado entre especies de Xanthomonas, dentro de este grupo de genes está el que codifica para el sistema de secreción tipo III y efectores patógenos, componentes clave en los procesos de infección de las células bacterianas a su planta huésped. Particularmente, proteínas HRP de Xanthomonas son producidas in situ en su planta hospedera durante los procesos de infección o in vitro en medios mínimos de crecimiento que imitan condiciones similares a su hospedero. El objetivo de este trabajo fue establecer un método de inducción, aislamiento y selección de proteínas HRP de bacterias fitopatógenas.

Aislamiento, purificación y cultivo de hepatocitos de rata

El órgano implicado en el metabolismo y la toxicidad de los xenobióticos es el hígado. Las principales células que forman parte de este órgano son los hepatocitos que se denominan genéricamente como células parenquimatosas y desempeñan las funciones metabólicas de este órgano. Por tanto, los hepatocitos
aislados de varias especies, incluida la humana y sus cultivos, constituyen modelos in vitro atractivos para la investigación básica de la función hepática, la fisiopatología, farmacología, y otros temas relacionados con el hígado. El método para el aislamiento de hepatocitos intactos se basa en la perfusión del hígado con colagenasa y fue introducido por primera vez por Berry y Friend en 1969, y desde entonces, ha sufrido modificaciones. Esencialmente, los hepatocitos se disocian del hígado de ratas adultas anestesiadas, por una perfusión de colagenasa a través de la vena porta. Las células aisladas se filtran a través de una malla de nylon para eliminar los restos de tejido no deseados y se obtiene una suspensión enriquecida de células parenquimatosas que se puede purificar mediante el método de elutriación para obtener hepatocitos puros. Los hepatocitos se pueden utilizar inmediatamente para realizar ensayos metabólicos en suspensión o se pueden cultivar en placas y utilizarlos por un periodo de 3 a 5 días.

Historia, fundamentos y métodos de la electroforesis de
proteínas en geles de poliacrilamida

La electroforesis es una de las técnicas más poderosas en la bioquímica y la biología molecular modernas, dado que permite separar macromoléculas para estudiarlas de manera aislada y definir sus propiedades, funciones y mecanismos en las importantes reacciones biológicas de los seres vivos. En este artículo nos concentraremos en la electroforesis de proteínas. Las funciones biológicas, aunque codificadas en el ADN o ARN en general las llevan a cabo las proteínas en todos los seres vivos, ya sea en forma de enzimas, receptores, transportadores, bombas primarias y secundarias, proteínas estructurales, etc. Es por ello que la electroforesis de proteínas es una técnica tan poderosa, no sólo permite analizar la pureza de una muestra, sino que ayuda a determinar interacciones con otras proteínas, sustratos, ligandos, etc, y además ayuda a determinar los niveles de expresión de las proteínas dentro de las células, lo cual permite definir la relevancia de la función de una proteína dentro de cualquier ser vivo. Por todas estas razones, la electroforesis de proteínas se revisará en su historia y fundamentos, así como los protocolos más comunes para su uso en los laboratorios ya sean de investigación, biomédicos, farmacéuticos, biotecnológicos o clínicos.

Expresión de proteínas recombinantes en un sistema heterólogo

Los sistemas de expresión en organismos procariontes y eucariontes se utilizan comúnmente para la sobreexpresión de proteínas recombinantes solubles. La elección de un sistema de producción adecuado es la base para lograr un buen rendimiento en la purificación de la proteína recombinante de interés. Aspectos como: la optimización del uso de codones, la elección de la cepa hospedera, el vector de expresión, la etiqueta o proteína de fusión a utilizar para la purificación, la composición del medio de cultivo, las condiciones de inducción, entre otros factores, son la clave para el resultado final. El nivel de expresión del gen blanco, así como los procesamientos post-traduccionales de la proteína recombinante sintetizada son algunos de los principales retos a los que se enfrentan la mayoría de los estudios realizados. Uno de los sistemas de sobreexpresión más utilizados sin duda es el procariota, en los que se incluyen principalmente a Escherichia coli. Esto debido a la facilidad de su manipulación genética, crecimiento celular, gran cantidad de biomasa, bajo costo, y la gran cantidad de cepas hospederas disponibles. De tal forma, que E. coli ha superado la barrera de realizar algunas modificaciones post-traduccionales que requieren algunas proteínas de origen e ucariota para su producción en este sistema. En este trabajo se discuten algunas estrategias que han ayudado a la obtención de proteínas recombinantes activas y funcionales en un sistema comercial de sobreexpresión como el BL21 y así mismo, se sugieren algunos protocolos para determinar las mejores condiciones de sobreexpresión de las proteínas recombinantes de interés.

Uso del sistema CRISPR-Cas9 para la edición de genes en organismos modelo y líneas celulares

El sistema CRISPR-Cas9 es una poderosa tecnología que permite editar el genoma eucarionte de manera rápida, precisa y eficiente. Esta herramienta ha revolucionado la manera de modificar el genoma de distintos organismos, desde microorganismos hasta mamíferos. Mediante el uso de CRISPR-Cas no es solo posible introducir mutaciones para estudiar la ausencia de un determinado gene, sino que también nos permite editar el genoma para introducir marcadores fluorescentes o incluso editar el epigenoma. Los protocolos de CRISPR-Cas9 se basan en introducir a las células tanto a la proteína Cas9 como a RNAs guías que dirigen al sistema junto con templados de homología. En este capítulo presentamos protocolos detallados para aplicar esta tecnología de edición genómica en distintos organismos modelo como el nematodo Caenorhabditis elegans, líneas celulares de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, el pez cebra Danio rerio y ovocitos de ratón. Esperamos que este capítulo permita a distintos grupos de investigación aplicar esta poderosa tecnología en sus modelos experimentales.

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