Para que la Ubiquitina se pueda activar se requiere que la enzima E1-activadora de ubiquitina, la cual procede de manera semejante a las aminoácil-tRNA sintetasas. E1 usa ATP para formar un anhídrido mixto (adenilato) con el extremo carboxilo de la Ubiquitina que luego transfiere al tiol de una cisteína de su sitio activo, formando un tioester.