En su sitio activo el Asp375 y la His274 realizan catálisis básica y ácida simultánea y promueven la formación de un doble enlace que es nucleofílico y ataca al carbonilo del oxaloacetato. Así se forma Citril-CoA, en una condensación tipo Claisen, que sería reversible.
Pero como la enzima promueve la hidrólisis del Citril-CoA, libera la energía y asegura que el citrato no se descondense.